2024 諾貝爾生理學或醫(yī)學獎：microRNA 開啟基因調控新維度
2024 年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎的頒布，再次吸引了全球科學界的目光。今年，這一殊榮授予了兩位科學家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他們因發(fā)現microRNA及其在基因轉錄后調控的作用，獲得2024年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。
圖1 2024年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲獎者，Victor Ambros和Gary Ruvkun
microRNA 的發(fā)現過程
故事要從 20 世紀 80 年代末說起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀麗隱桿線蟲（現在都已成為模式生物了）的生命進程，他們將目標鎖定在了兩個突變株 “l(fā)in-4” 和 “l(fā)in-14”上。Ambros驚奇地發(fā)現，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “負調控者”，但其中的抑制機制卻如同籠罩在一層迷霧之中，讓人捉摸不透。
時光流轉，Ambros直到博士后生涯結束，才在哈佛大學的實驗室里意外迎來了重大突破。他發(fā)現，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，極有可能是 lin-4 產生的一種超短 RNA。與此同時，Ruvkun也有了驚人發(fā)現，他察覺到 lin-4 并不影響 lin-14 基因產生mRNA，而是阻止 mRNA 產生蛋白質。并且，他還找到了 lin-14轉錄mRNA 上的一個關鍵位置，這個位置就是 lin-4 對其進行抑制的結合位點。
當Ambros和Ruvkun交流彼此的發(fā)現后，一個具有突破性的結論誕生了：lin-4 中的超短 RNA 與 lin-14 中 mRNA 的關鍵片段序列互補，正是通過這種奇妙的結合，超短 RNA 如同一個“開關”，“關閉”了 lin-14基因的表達，阻止它產生蛋白質。這一發(fā)現，揭開了以前從未被知曉的、基于 microRNA 的基因調控機制。因為在此之前，科學家們一直認為是一種名為 “轉錄因子” 的特殊蛋白質，通過與 DNA 的特定區(qū)域結合，來決定產生哪些 mRNA，從而實現基因調控。
圖2 Ambros和Ruvkun發(fā)現lin-4來源的microRNA過程
限于當時的環(huán)境和人們的認知，他們的發(fā)現之路并非一帆風順。1993 年，當Ambros和Ruvkun在《Cell》雜志上發(fā)表這一創(chuàng)新成果時，卻并沒有引起科學界過多的關注。盡管這是前所未有的重大發(fā)現，但科學界卻認為這種機制可能僅僅是秀麗隱桿線蟲的獨特特性，與人類和其他更復雜的動物毫無關系。
但命運的轉折總是充滿戲劇性，2000 年時，當Ruvkun研究小組公布他們發(fā)現的另一種由 let-7 基因編碼的 microRNA 時，曾經的沉默瞬間被打破，引起了巨大的轟動。因為與 lin-4 不同，let-7 基因普遍存在于整個動物界。這一驚人發(fā)現如同在科學界投下了一顆重磅炸彈，引發(fā)了一場激烈的研究熱潮。在接下來的幾年里，數百種不同的 microRNA 被一一鑒定出來。
圖3 Ruvkun克隆了第二個編碼microRNA的基因let-7，該基因在進化中是保守的且普遍存在于整個動物界
如今，人體內超過一千種 microRNA 已被發(fā)現?？梢院敛豢鋸埖卣f，沒有它們，細胞和組織就無法正常發(fā)育，而它們的異常和突變甚至可能引發(fā)癌癥等嚴重疾病。microRNA 的出現，就像是為生命的基因調控世界打開了一扇全新的大門，揭示了一個全新的維度，它對所有復雜的生命形式都至關重要。
圖4 自1993-2000發(fā)現microRNA開始的microRNA研究進程
microRNA 的應用
近些年來由于對microRNA研究的比較多，我們知道m(xù)icroRNA 是一類由內源基因編碼的長度約為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子。它通過與靶 mRNA 結合，抑制其翻譯或促進其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。
圖5 microRNA的開創(chuàng)性發(fā)現揭示了基因調控的一個新維度
醫(yī)學領域
在醫(yī)學領域，microRNA 展現出了巨大的潛力，可作為疾病的重要生物標志物。例如，眾多研究已表明，在某些癌癥中，特定的 microRNA 表達水平會發(fā)生顯著變化。Lan 等人在權威期刊《Biomedical Research International》發(fā)表的論文中深入探討并強調了 microRNA 作為癌癥潛在生物標志物的重大意義。以肝癌為例，大量研究發(fā)現，在不同類型的癌癥（肺癌、肝癌、結直腸癌等）患者中，不同的microRNA的表達水平有非常明顯的變化。通過對血液中microRNA含量的精準檢測，能夠為癌癥的早期診斷提供極為重要的參考依據。
同時，microRNA 為疾病治療開辟了新的策略。Krützfeldt 等人在國際著名期刊《Nature》發(fā)表的研究中，創(chuàng)新性地介紹了 “antagomirs” 這種反義寡核苷酸，它可在體內有效地沉默 microRNA。通過使用特定的 microRNA 模擬物或抑制劑，可以精準地調節(jié)相關基因的表達，進而為疾病治療帶來新的希望。在一些癌癥的治療研究中，科學家們積極探索使用 microRNA 抑制劑來抑制腫瘤細胞的生長和擴散。例如，針對某些特定類型的癌癥，研究人員發(fā)現特定的 microRNA 抑制劑能夠靶向作用于腫瘤細胞中的關鍵基因，從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，為癌癥治療提供了新的思路和方法。
農業(yè)領域
在農業(yè)領域，microRNA 在植物的生長發(fā)育和抗逆性中起著至關重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》發(fā)表的文章中，系統(tǒng)地強調了 microRNA 在作物復雜性狀改良中的重要意義。通過調控植物中的 microRNA 表達，可以有效地改良農作物的品質和產量。比如，在面對干旱、鹽堿等不良環(huán)境時，調節(jié)與植物抗逆性相關的 microRNA，可以顯著提高農作物的耐受性。此外，還可以利用 microRNA 技術來培育具有特定性狀的轉基因農作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探討了 microRNA 介導的基因調控在植物基因工程中的潛在應用。通過對特定 microRNA 的調控，可以實現對農作物生長發(fā)育過程的精準干預，培育出具有高產、優(yōu)質、抗逆等優(yōu)良性狀的農作物品種，為農業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展提供了新的技術手段。
研究方法
那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的實驗方法和技術手段也是豐富多樣的，下面跟大家介紹一些常用的實驗研究方法。
① Northern Blot
這是一種經典的 RNA 檢測方法。通過電泳將 RNA 分離，然后將其轉移到膜上，利用特定的 microRNA 探針進行雜交，檢測 microRNA 的表達水平。雖然該方法相對較為繁瑣，但具有較高的特異性和準確性。
圖6 Northern Blot檢測的靈敏度和準確性
② 基因芯片技術
這是一種高通量的檢測方法，可以同時檢測大量 microRNA 的表達水平。通過將已知的 microRNA 探針固定在芯片上，與樣本中的 microRNA 進行雜交，然后利用熒光或其他信號檢測技術，快速獲取樣本中 microRNA 的表達譜。這種方法能夠全面地了解不同生理或病理狀態(tài)下 microRNA 的變化情況，為研究 microRNA 的功能提供重要線索。這種方法成本較高；可能存在假陽性和假陰性結果；對樣本的質量和數量要求較高。
③ 實時定量 PCR（RT-qPCR）
該方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高靈敏度和特異性，能夠準確地檢測出微量的 microRNA。通過設計針對特定 microRNA 的引物和探針，利用 PCR 技術對 microRNA 進行擴增，并實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，從而計算出 microRNA 的相對或絕對表達量。由于其操作相對方便，方法簡單，通量高，已經成為實驗室里面常用的一種檢測microRNA的方法了。
這種方法首先要把 RNA 提取出來，microRNA 的 qPCR 的檢測與正常的基因無明顯差異，但由于 microRNA 比較小，所以需要的特殊的反轉錄方法。常用的反轉錄方法有兩種，一種為莖環(huán)法（Stemloop specific primer），一種為加尾法（Universal primer）。
圖7 microRNA常見的2種反轉錄的方式
④ RNA 干擾技術
這是一種研究 microRNA 功能的有力工具。通過導入特定的小干擾 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制劑，可以特異性地抑制目標 microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模擬物可以增強 microRNA 的活性。通過觀察細胞或生物體在 microRNA 功能改變后的表型變化，可以推斷出 microRNA 的生物學功能。
⑤ 生物信息學分析
隨著高通量測序技術的發(fā)展，產生了大量的 microRNA 序列數據。生物信息學方法可以用于分析這些數據，預測新的 microRNA、識別 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的進化和功能保守性。例如，利用序列比對算法，可以在不同物種中尋找保守的 microRNA，從而揭示 microRNA 在進化過程中的重要作用。
⑥ 細胞和動物模型實驗
構建細胞和動物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通過在細胞系中過表達或抑制特定的 microRNA，可以觀察細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程的變化。在動物模型中，可以通過基因敲除、轉基因等技術來研究 microRNA 在體內的功能。例如，構建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠發(fā)育、生理和疾病中的作用。
圖8 整體原位microRNA 雜交（Whole-mount miRNA ISH）技術在生物發(fā)育中的應用
⑦ microRNA 活性檢測方法
? 報告基因法：構建含有 microRNA 靶序列和報告基因（如熒光素酶基因）的載體，當 microRNA 與靶序列結合時，會抑制報告基因的表達。通過檢測報告基因的活性變化，可以間接反映 microRNA 的活性。其中熒光素酶報告系統(tǒng)由于操作簡單、靈敏度高，已廣泛的應用于microRNA的活性及靶標檢測。更詳細的方法可以參看下方的視頻。
復制下方鏈接，可查看完整視頻
http://qdkoyo.com/technology_video.html
? Western blot 檢測靶蛋白法：microRNA 通過與靶 mRNA 結合抑制其翻譯，從而降低靶蛋白的表達水平。通過 Western blot 技術檢測靶蛋白的表達量變化，可以推斷 microRNA 的活性。
? RNA 結合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗體特異性地結合與 microRNA 結合的 RNA 結合蛋白，然后通過免疫沉淀分離出與該蛋白結合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通過檢測沉淀下來的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其與靶 mRNA 的結合情況。
TransGen 相關產品
小 RNA 提取試劑盒 (ER601)
產品特點
★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
★ 適用于從細胞、組織、新鮮血液、外泌體中提取 miRNA 和 Total RNA
★ 通過調整加入水相中無水乙醇的用量，可獲得：
1. RNA 離心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，將流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再經 miRNA 離心柱吸附 Small RNA；
2. RNA 離心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)
★ 裂解能力強、提取量高、應用范圍廣
數據展示
分別用 miRNA 提取產品提取 miRNA，2 個重復，用 miRNA 反轉錄產品反轉后進行 qPCR 檢測
強化 RNA 提取試劑盒 (ET111)
產品特點
與其它總 RNA 提取試劑相比，裂解能力強、速度快，RNA 的提取量與純度更高。
? 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
? 適用于快速提取多種組織和細胞中的總 RNA
? 應用范圍廣：動物、植物組織、血液和細菌等樣品。小量樣品 (50-100 mg 組織、5×106 細胞、200 μL 血液 )。大量樣品 ( ≥1 g 組織或 ≥107 細胞 )
? 提取速度快：一個小時內可完成反應
? 操作可視化：溶液呈粉紅色，便于分離水相和有機相
? 提取純度高：DNA 和蛋白質的污染低
? RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低對反轉錄反應的抑制
數據展示
TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
TransScript miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒 (AT351)
產品特點
★ 適用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的樣品反轉錄
★ 優(yōu)化的加尾酶和反轉錄酶配比及反應緩沖液，確保 miRNA 的反轉錄效率
★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反應體系中一步完成
數據展示
? 批次間穩(wěn)定性好
使用不同批次產品分別以從人血漿中提取的 miRNA 為模板，進行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化判斷該產品批次間的穩(wěn)定性。
? 反轉錄效率高
使用 TransGen 和 Company TA 產品，分別以從人血漿中提取的miRNA 為模板，進行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化分析反轉錄效果。
TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成試劑盒 (AT311)
產品特點
★ 在同一反應體系中，同時完成反轉錄與基因組 DNA 的去除，操作簡便，降低污染幾率
★ 產物用于 qPCR：反轉錄 15 分鐘；產物用于 PCR：反轉錄 30 分鐘
★ 反應結束后，同時熱失活 RT/RI 與 gDNA Remover
★ 合成片段 ≤12 kb
數據展示
? 反轉錄效率高
? 高效基因組去除
使用不同批次產品分別以人 100 ng 總 RNA、人 100 ng 總 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 為模板，進行 RT-PCR 檢測，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 檢測 18S DNA 表達量。
PerfectStart? Green qPCR SuperMix
染料法熒光定量預混試劑（AQ601）
產品特點
★ 3 種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率強，適用物種范圍廣
★ 雙陽離子緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，數據準確
★ 配有適用于不同機型的 Universal Passive Reference Dye ( 調整 PCR 加樣誤差引起的管間差異 )，校正孔間信號誤差
數據展示
? 擴增效率高
以梯度稀釋的質粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀釋 ) 為模板進行擴增得到的擴增曲線和標準曲線。結果顯示，TransGen 產品擴增效率較高，可得到漂亮的擴增曲線和標準曲線。
? 不同物種模板擴增
以不同物種的 RNA 反轉錄 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 為模板分別使用 TransGen 與 Company T 的產品進行擴增 (NTC 無擴增 )。結果顯示，TransGen 產品擴增效果與 Company T 產品基本一致。
產品信息
精選文獻
? Duan H J, Chu H Q, Cao T M, et al. Investigation of the cell composition and gene expression in the delayed-type hypersensitivity tuberculin skin test[J]. Military Medical Research, 2023. 使用產品TransZol Up (ET111)
? Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022. 使用產品TransZol Up (ET111)
? He X, Yang L, Huang R, et al. Activation of CB2R with AM1241 ameliorates neurodegeneration via the Xist/miR‐133b‐3p/Pitx3 axis[J]. Journal of cellular physiology, 2020. 使用產品EasyPure? miRNA Kit (ER601)
? Huang R, Jia B, Su D, et al. Plant exosomes fused with engineered mesenchymal stem cell‐derived nanovesicles for synergistic therapy of autoimmune skin disorders[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2023. 使用產品TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
? Zhao J, Zeng X, Liu J, et al. Marasmius androsaceus mitigates depression-exacerbated intestinal radiation injuries through reprogramming hippocampal miRNA expression[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023. 使用產品TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
? Gong Q, Wang Y, He L, et al. Molecular basis of methyl-salicylate-mediated plant airborne defence[J]. Nature, 2023. 使用產品TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
? Wan W, Dong H, Lai D H, et al. The Toxoplasma micropore mediates endocytosis for selective nutrient salvage from host cell compartments[J]. Nature communications, 2023. 使用產品TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis
? Bing C, Kangyu J, Jingyi D, et al. LuHypocretin-1/hypocretin receptor 1 regulates neuroplasticity and cognitive function through hippocampal lactate homeostasis in depressed model. Advanced science, 2024. 使用產品PerfectStart? Green qPCR SuperMix
? Zhang B, He P, Lawrence J E G, et al. A human embryonic limb cell atlas resolved in space and time[J]. Nature, 2023. 使用產品PerfectStart? Green qPCR SuperMix
展望
對 microRNA 的未來研究充滿期待。在研究方向上，科學家們將進一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理過程中的作用機制，以及與其他基因調控因子的相互關系。在疾病治療方面，有望開發(fā)出基于 microRNA 的新型藥物，為癌癥等嚴重疾病的治療帶來新的突破。同時，隨著技術的不斷進步，對 microRNA 的檢測和調控方法也將更加精準和高效。
涉及到的參考文獻
? Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993;75(5):843-854. doi:10.1016/0092-8674(93)90529-y
? Wightman B, Ha I, Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 1993;75(5):855-862. doi:10.1016/0092-8674(93)90530-4
? Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kurodak MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Müller P, Spring J, Srinvasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, Davidson E, Ruvkun G. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 2000;408(6808):86-89. doi:10.1038/35040556
? https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2024/press-release/
? Lan, H., Lu, H., Wang, X., & Jin, H. (2015). MicroRNAs as potential biomarkers in cancer: opportunities and challenges. Biomedical Research International, 2015, 125094.
? Sundarbose, K., Kartha, R. V., & Subramanian, S. (2013). MicroRNAs as biomarkers in cancer. Diagnostics (Basel), 3(1), 84–104.
? Krützfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R., Rajeev, K. G., Tuschl, T., Manoharan, M., & Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature, 438(7068), 685–689.
? Esau, C., Davis, S., Murray, S. F., Yu, X. X., Pandey, S. K., Pear, M.,... & Lollo, B. A. (2006). miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell metabolism, 3(2), 87–98.
? Eva van Rooij. "The art of microRNA research." Circulation Research 108.2 (2011): 219-234. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.110.227496.
? Tang, J., & Chu, C. C. (2017). MicroRNAs in crop improvement: fine-tuners for complex traits. Nature Plants, 3, 17077.
? Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., & Anderson, T. A. (2006). Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology, 289(1), 3–16.
? Zhou, M., & Luo, H. (2013). MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant genetic engineering. Plant Molecular Biology, 83(1-2), 59–75.
? Zheng, L. L., & Qu, L. H. (2015). Application of microRNA gene resources in the improvement of agronomic traits in rice. Plant Biotechnology Journal, 13(2), 329–336.
? Kim, D. H., Saetrom, P., Snove, O., Jr., & Rossi, J. J. (2008). MicroRNA-directed transcriptional gene silencing in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(42), 16230–16235.
? Wienholds, E., Koudijs, M. J., van Eeden, F. J., Cuppen, E., & Plasterk, R. H. (2003). The microRNA-producing enzyme Dicer1 is essential for zebrafish development. Nature Genetics, 35(3), 217–218.
? Wang, K., Zhang, S., Wu, H., Ma, L., & Wang, P. (2015). MicroRNA biosensors: opportunities and challenges among conventional and emerging detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 66, 160–170.
? Fang, X., & Tan, W. (2013). MicroRNA detection using microarrays: challenges and promises. Biosensors and Bioelectronics, 41, 49–55.
