等溫擴(kuò)增技術(shù)系列
近些年來，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展持續(xù)推動著分子診斷技術(shù)的升級迭代，伴隨著新冠疫情的爆發(fā)，分子診斷技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮著重大作用，人們對分子診斷技術(shù)的重視程度達(dá)到了前所未有的高度。自沃森和克里克揭秘“生命之謎”-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)始，分子診斷經(jīng)分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)和二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展后，已經(jīng)在多個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如傳染病的診斷、流行病學(xué)的調(diào)查、腫瘤和遺傳病的早期診斷、食品衛(wèi)生安全等。
其中，作為分子診斷經(jīng)典技術(shù)之一的PCR，憑借其簡便快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，成為目前臨床基因擴(kuò)增實驗室接受程度最高、應(yīng)用范圍最廣的技術(shù)。然而，PCR技術(shù)是在體外通過反復(fù)的溫度變化來達(dá)到對目的片段在短時間內(nèi)擴(kuò)增數(shù)百萬倍的效果，這也就意味著PCR技術(shù)無法擺脫儀器設(shè)備的局限，不僅如此，PCR技術(shù)操作起來比較復(fù)雜，對人員要求也比較高，這些問題進(jìn)一步限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。為了解決PCR這一局限性，自20世紀(jì)90年代以來，很多實驗室開始自發(fā)的研究無需熱變性的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)(Isothermal Amplification Technology, IAT)。
等溫擴(kuò)增技術(shù)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)過程始終在一個恒定的溫度下進(jìn)行，通過在反應(yīng)體系中添加不同活性的酶和各種特異性的引物來達(dá)到快速擴(kuò)增的目的。經(jīng)過30多年的發(fā)展，主流的等溫擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴(kuò)增(crossing priming amplification，CPA)、鏈替代擴(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)和依賴解旋酶的擴(kuò)增(helicase-dependent amplification，HDA)。
在這些恒溫擴(kuò)增技術(shù)中，以2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開的LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，也就是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)最受關(guān)注，是目前最常見、應(yīng)用最廣泛的等溫擴(kuò)增技術(shù)，已占據(jù)超過60%的恒溫檢測市場。被廣泛地運用在病原微生物檢測和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域，如SARS、AIV、HIV、COVID-19等疾病的檢測中，為已知基因的檢測提供簡便、快速、特異、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，顯示出令人鼓舞的應(yīng)用前景。
LAMP原理
最初的LAMP反應(yīng)是針對目的DNA鏈上的6個區(qū)域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）設(shè)計4條引物，包含一對外引物（F3&B3）和一對內(nèi)引物（FIP&BIP）。其原理是利用雙鏈DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在此溫度下，引物結(jié)合在雙鏈DNA的互補部位，鏈置換DNA聚合酶將DNA雙鏈解開并進(jìn)行鏈置換，使DNA在15-60分鐘內(nèi)即可擴(kuò)增109-1010倍。
LAMP擴(kuò)增體系
基于LAMP擴(kuò)增的原理，LAMP的擴(kuò)增體系包括4條特異性引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、MgSO4。
4條特異性引物的組成：
· 正向外引物F3：由F3區(qū)域組成，該區(qū)域與F3c區(qū)域互補；
· 反向外引物B3：由B3區(qū)域組成，該區(qū)域與B3c區(qū)域互補。
· 正向內(nèi)引物FIP：由與F2c區(qū)互補的F2區(qū)（3’端）和與5’端的F1c區(qū)相同序列組成。
· 反向內(nèi)引物BIP：由與B2c區(qū)互補的B2區(qū)（3'端）和與5'端的B1c區(qū)域相同序列組成。
LAMP引物設(shè)計
正確的引物設(shè)計對于進(jìn)行LAMP擴(kuò)增至關(guān)重要，LAMP引物設(shè)計時，需注意以下幾點：
· 引物間距：F2和B2的5'端之間的距離為120-180 bp，F(xiàn)2和F3以及B2和B3之間的距離為0-20 bp。莖環(huán)區(qū)域的距離（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）為40-60 bp。
· 引物的Tm值：高GC和正常情況下約60-65℃，高AT情況下約55-60℃。
· 引物末端的穩(wěn)定性：從以下末端區(qū)域計算6bp的dG應(yīng)小于-4 kcal/mol，分別是F1c/B1c 的5'末端和F2/B2以及F3/B3的3'末端。
· GC含量：高GC和正常的情況下約為50-60%，高AT的情況下約為40-50%。
· 二級結(jié)構(gòu)：引物設(shè)計應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)，3'序列應(yīng)避免高AT或與其他引物互補。
· 其他：如果目標(biāo)序列上存在限制性內(nèi)切酶位點，除了引物區(qū)域外，它們可以用來確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。
LAMP反應(yīng)核心的Bst DNA聚合酶，源于Geobacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌），原菌種生長于55-60℃的環(huán)境中。野生型Bst DNA Polymerase和其他DNA Polymerase I相似，包括三個活性區(qū)域: (I) 5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，(II) 5’-3’聚合酶活性結(jié)構(gòu)域，(III) 3’-5’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域II和III稱為大片段(LF)（大片段的反應(yīng)效率比全長Bst高），位于Bst DNA聚合酶的羧基末端，缺失5’-3’外切酶活性。
Bst DNA聚合酶的鏈置換原理
LAMP擴(kuò)增步驟
當(dāng)目的基因和試劑在65℃條件下孵育時，等溫擴(kuò)增反應(yīng)分為2個階段進(jìn)行，分別是啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成過程、循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸循環(huán)階段。步驟如下：
1. 啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成：內(nèi)引物結(jié)合目的基因，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5’結(jié)合，在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)過同樣過程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。
2. 循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸循環(huán)階段：以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導(dǎo)過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，最后形成具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度不一的DNA混合物。
LAMP擴(kuò)增步驟
LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
LAMP擴(kuò)增后可產(chǎn)生大量具有不同長度、不同數(shù)目莖環(huán)結(jié)構(gòu)和反向重復(fù)序列的DNA混合物，此外，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的不斷進(jìn)行，副產(chǎn)物焦磷酸鎂的含量也在不斷增加。由于LAMP反應(yīng)的特殊性，其擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測也存在多種方式。
· 瓊脂糖凝膠電泳法：通過瓊脂糖凝膠電泳對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果呈現(xiàn)瀑布狀梯形條帶，針對擴(kuò)增產(chǎn)物中所包含的特異性酶切位點進(jìn)行酶切，還可以對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性進(jìn)行驗證。但高濃度DNA產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠造成實驗室環(huán)境污染。
· 濁度分析鑒定法：LAMP反應(yīng)的效率極高，核酸在大量合成的同時，由dNTP析出的焦磷酸根離子與體系中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，形成乳白色沉淀，焦磷酸鎂的產(chǎn)量與擴(kuò)增產(chǎn)物濃度存在一定相關(guān)性?？捎萌庋塾^察擴(kuò)增終末階段的乳白色沉淀判斷擴(kuò)增有效性，也可利用濁度儀對濁度變化進(jìn)行實時監(jiān)測。但濁度信號是來源于LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物，而不是由引物特異性擴(kuò)增的直接產(chǎn)物，因此無法完全排除檢測到非特異性擴(kuò)增（如，由宿主來源的近源DNA片段或引物二聚體）的可能。
· 染色檢測法：根據(jù)染料對反應(yīng)是否產(chǎn)生抑制，染料可在反應(yīng)后或反應(yīng)前添加。在反應(yīng)后開蓋添加，易在空氣中產(chǎn)生氣溶膠，并在之后的檢測中造成假陽性。染料和輔助劑的種類也會對反應(yīng)效率及結(jié)果判斷造成影響。因此，根據(jù)染料、輔助劑的作用特點進(jìn)行合理的選擇及應(yīng)用，對LAMP結(jié)果的正確性和可靠性有重要意義。染料的種類有很多，應(yīng)用較多的有3種：鈣黃綠素、SYBR Green 和羥基萘酚藍(lán)。
· 免疫試紙條法：特異性擴(kuò)增產(chǎn)物能夠同時被質(zhì)控線（C）和檢測線（T）上的抗體捕獲并顯現(xiàn)為兩條紅色條帶，而非特異性擴(kuò)增的樣品則僅僅顯示為質(zhì)控線（C）紅色，但該方法需要借助其他的裝置來防止核酸擴(kuò)增結(jié)束后開蓋可能造成的交叉污染。
· 實時熒光法：利用SYBR Green I等熒光染料能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合的特性，通過核酸擴(kuò)增過程中的熒光強度變化來實時、定量地檢測雙鏈DNA的產(chǎn)量。該方法具有重復(fù)性高、能夠定量、實時分析的特點，但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 熒光探針法：向LAMP反應(yīng)體系中加入標(biāo)記不同熒光素的特異性探針，可用于多重基因的檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 微流控芯片法：該方法具有特異性強、敏感度高、耗樣量少、耗時短、檢測效率高、操作簡便等諸多優(yōu)點。將環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立單重/多重、定性/定量的LAMP微流控芯片模塊，有利于發(fā)展快速、靈敏、特異和適合床邊檢測的生物分子分析技術(shù)。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
LAMP的優(yōu)勢與限制
LAMP的優(yōu)勢：
· 不需額外的步驟將雙鏈DNA變成單鏈DNA；
· 擴(kuò)增反應(yīng)在等溫條件下連續(xù)進(jìn)行；
· 擴(kuò)增效率極高，在15-60分鐘內(nèi)使DNA的量放大109-1010倍；
· 通過4個引物來識別6個區(qū)域，擴(kuò)增的特異性強；
· 不需要特殊的試劑或復(fù)雜的設(shè)備，成本低；
· RNA模板的擴(kuò)增過程與DNA模板相同，只需添加逆轉(zhuǎn)錄酶。
LAMP的限制：
· 引物設(shè)計要求高；
· 產(chǎn)物不能用于克隆或測序；
· 容易形成氣溶膠污染，造成假陽性。
產(chǎn)品推薦
全式金作為國產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商，為滿足廣大客戶對LAMP技術(shù)在病原微生物檢測、傳染性疾病診斷和食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域的應(yīng)用需求，推出Bst II DNA Polymerase和Bst III DNA Polymerase，助力診斷試劑開發(fā)。
適用于以DNA為模板的LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增能力強、特異性高，在熒光定量法（染料法、探針法）LAMP反應(yīng)中具有極佳的反應(yīng)性能。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單：包含反應(yīng)所需組分，只需自備模板及引物探針即可。
· 高效率：強鏈置換及聚合酶活性，實現(xiàn)恒溫條件下快速、高效、特異性的LAMP擴(kuò)增。
· 操作可視化：擴(kuò)增結(jié)果可通過肉眼觀察進(jìn)行判讀。
· 兼容dUTP/UDG：對dUTP耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。
實驗數(shù)據(jù)：
擴(kuò)增靈敏度高
以不同濃度的番鴨細(xì)小病毒（MDPV）質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級別。
注：1*102 copies濃度為fg級別
反應(yīng)可視化
以ASFV-p72基因質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行濁度法、HNB和中性紅顯色法LAMP擴(kuò)增，63℃反應(yīng)30 min。結(jié)果表明TransGen產(chǎn)品可進(jìn)行可視化操作，擴(kuò)增結(jié)果均可通過顏色變化進(jìn)行判讀。
1-3：ASFV-p72基因質(zhì)粒；4-6：NTC
Bst II DNA Polymerase (可凍干版本)(LP302)
適用于以DNA為模板的RT-LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系可用于凍干。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單
· 穩(wěn)定性好
· 可直接凍干
· 靈敏度高，抗抑制能力強
· 提供定制凍干服務(wù)
實驗數(shù)據(jù)：
靈敏度高
以非洲豬瘟陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用 LP302 凍干微球和 LP301液體試劑進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增，結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品靈敏度高，染料法和探針法均可檢測出 5 copies 的質(zhì)粒模板。
Bst III Fluorescent LAMP Kit (DNA&RNA) (LP312)
適用于以RNA為模板的染料法RT-LAMP反應(yīng)或者以DNA為模板的染料法LAMP反應(yīng)，具有極強的反轉(zhuǎn)錄活性和擴(kuò)增能力，可在30分鐘內(nèi)檢測低至1拷貝的RNA或者DNA分子。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單
· 穩(wěn)定性好
· 可直接凍干
· 靈敏度高，抗抑制能力強
· 提供定制凍干服務(wù)
實驗數(shù)據(jù)：
靈敏度高
以103 copies 的豬藍(lán)耳病毒陽性質(zhì)粒為模板，使用 TransGen、 Company HB 和 Company HG 產(chǎn)品進(jìn)行 RT-LAMP 染料法擴(kuò)增，結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品靈敏度高，擴(kuò)增效果優(yōu)于 Company HG，與 Company HB 相當(dāng) 。
Bst III Probe LAMP Kit (DNA&RNA) (LP313)
適用于以RNA為模板的探針法RT-LAMP反應(yīng)或者以DNA為模板的探針法LAMP反應(yīng)，具有極強的反轉(zhuǎn)錄活性和擴(kuò)增能力，可在30分鐘內(nèi)檢測低至1拷貝的RNA或者DNA分子。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單
· 穩(wěn)定性好
· 可直接凍干
· 靈敏度高，抗抑制能力強
· 提供定制凍干服務(wù)
實驗數(shù)據(jù)：
靈敏度高
以500 copies 的豬藍(lán)耳病毒陽性質(zhì)粒為模板，使用 TransGen、 Company HB 和 Company HG 產(chǎn)品進(jìn)行 RT-LAMP 探針法擴(kuò)增，結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品靈敏度高，擴(kuò)增效果優(yōu)于競品。
相關(guān)產(chǎn)品信息
參考文獻(xiàn)：
【1】 Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR?. Cells. 2021;10(8):1931. Published 2021 Jul 29.
【2】 Li JJ, Xiong C, Liu Y, Liang JS, Zhou XW. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Emergence As an Alternative Technology for Herbal Medicine Identification. Front Plant Sci. 2016;7:1956. Published 2016 Dec 26.
【3】 姜蘇,李一榮.等溫擴(kuò)增技術(shù)的原理及應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2020,43(05):591-596.
